Orinoquia

Orinoquia, Volumen 16, Número 1, p. 46-62, 2012. ISSN electrónico 2011-2629. ISSN impreso 0121-3709.

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ARTÍCULO DE REVISIÓN/REVIEW ARTICLE

Inmunoestimulantes en teleosteos: Probióticos, β-glucanos y LPS

Immunostimulants in teleost fish: probiotics, β-glucans and lipopolysaccharides

Imunoestimulantes em teleósteos: Probióticos, Beta-glucanas e LPS

Mónica A. Vásquez - Piñeros1*, Iang S. Rondón - Barragan2, Pedro R. Eslava- Mocha3*

1* Bióloga Marina, MSc, 2 MVZ,MSc, Grupo de Investigación en Inmunología y Fisiopatología Animal, Universidad del Tolima, 3 MV, MSc.

* Grupo de Investigación en Sanidad de Organismos Acuáticos, Universidad de los Llanos.

Email: mandreavasquez@gmail.com

Recibido: septiembre 16 de 2011 Aceptado: marzo 05 de 2012

Resumen

Los inmunoestimulantes son principalmente, elementos estructurales de microorganismos, que basan su principio en la estimulación del sistema inmune innato, mostrando mejoramiento del estado sanitario de los animales e incremento de la resistencia frente a patógenos. Dentro de los inmunoestimulantes más utilizados en peces se encuentran los β-glucanos, los lipopolisacáridos y se incluyen las bacterias benéficas, denominadas probióticos. Los estudios realizados en peces se han enfocado en evaluaciones in vitro e in vivo de las respuestas celulares y humorales, la modulación de la transcripción génica y los efectos de resistencia frente a patógenos de interés; mostrando de manera general efectos positivos sobre el estado inmunológico de los peces y resistencia a enfermedades. La revisión propuesta intenta indagar sobre mecanismos de acción de algunos inmunoestimulantes de mayor uso, conceptualizar su uso en acuicultura y discutir acerca de trabajos recientes sobre el tema, lo cual servirá de base en el planteamiento de investigaciones pertinentes y factibles para abordar algunas problemáticas en el área sanitaria piscícola.

Palabras clave: acuicultura, enfermedad, peces, sanidad, sistema inmune

Abstract

Immunostimulants mainly consist of microorganisms’ structural elements whose principle is based on stimulating the innate immune system, leading to an improvement in animals’ sanitary state and increased resistance to pathogens. β-glucans and lipopolysaccharides are some of the most used immunostimulants in the fish industry, including beneficial bacteria called probiotics. Studies on fish have been focused on the in vitro and in vivo evaluation of cellular and humoral responses, modulating gene transcription and the effects of resistance regarding pathogens of interest, usually having positive effects on the fishes’ immunological state and resistance to disease. The proposed review was aimed at investigating the mechanisms of action of some of the most used immunostimulants, conceptualising their use in aquiculture and discussing recent work on the topic thereby forming the basis for proposing pertinent, feasible investigations for tackling some problems in the fish-farming health/sanitation area.

Key words: aquiculture, disease, fish, health/sanitation, immune system

Resumo

Os imunoestimulantes são principalmente elementos estruturais de microorganismos, que basam seu principio na estimulação do sistema imune inato, apresentando melhoramento do estado da saúde dos animais e maior resistência a patógenos. Entre os imunoestimulantes mais utilizados em peixes estão as β-glucanas, os lipopolissacarídeos e incluso as bactérias benéficas, chamados probióticos. Estudos feitos em peixes têm-se centrado em avaliações in vitro e in vivo das respostas celulares e humorais, a modulação da transcrição de genes e os efeitos da resistência aos agentes patogênicos de interesse, em geral, mostrando efeitos positivos sobre o estado imunitário dos peixes e a resistência a doenças. A revisão proposta tenta indagar sobre os mecanismos de ação de alguns imunoestimulantes de mais uso, sua utilização em aquicultura e discutir acerca de trabalhos recentes sobre o assunto, que servirá de base para a formulação de pesquisas relevantes e viáveis para resolver alguns problemas na área da saúde de peixes.

Palavras chave: aqüicultura, doença, peixe, saúde, sistema imunológico

Introducción

Actualmente, la piscicultura ha tenido un amplio crecimiento, constituyendo uno de los pilares de la economía pecuaria (Kapetsky y Nath, 1997; FAO, 2009; SOFIA, 2009); por esta razón se han diseñado alianzas estratégicas y redes internacionales que fortalezcan este sector, que estimulen los sistemas de producción y reduzcan el impacto ambiental (SOFIA, 2009; FAO, 2010). No obstante, el incremento en la presión de estos sistemas productivos, con el fin de ser más competitivos frente a las exigencias de los mercados y la necesidad de elevar la eficiencia, favorece la aparición de enfermedades principalmente en sistemas intensivos, por lo que se opta por la terapéutica antibiótica como respuesta inmediata, convirtiéndose de uso común en el sector. Se ha demostrado que el uso indiscriminado de antibióticos ha conllevado a la generación de bacterias resistentes, eliminación de bacterias benéficas que limita su competencia con microorganismos patógenos, compromete la respuesta inmune en niveles terapéuticos (Lunden y Bylund, 2002; Serezlí et al., 2005) y posee efectos deletéreos sobre el medio ambiente. Por tal razón, emerge la demanda de productos orgánicos, productos verdes, y en general productos ambientalmente amigables y favorables para la salud humana, que requieren de herramientas alternativas que no solo mitiguen la morbi-mortalidad, sino que mejoren la sostenibilidad y la calidad de los productos de los sistemas acuícolas. Aunque algunas sustancias como los inmunoestimulantes y los probióticos responden a esta necesidad, se requieren estudios rigurosos en diferentes especies de consumo que validen la efectividad del uso de estos productos de manera cotidiana, para el mejoramiento de la salud y sobrevivencia de los peces, y por ende la disminución del uso de antibióticos y antimicrobianos.

Inmunoestimulantes

Definición y usos

Los inmunoestimulantes se han definido como sustancias que potencian el sistema inmunitario y aumentan la resistencia frente a las enfermedades infecciosas (Rodríguez et al., 2003). Raa (2000), los enmarca como compuestos químicos, los cuales existen como elementos estructurales principalmente de las bacterias, hongos miceliales y levaduras, que activan los leucocitos y por tanto confieren al animal mayor resistencia a las enfermedades causadas por virus, bacterias, hongos y parásitos. Por otro lado, Sahoo (2007), los definió como compuestos químicos, (sintéticos o naturales), que actúan sobre los mecanismos de respuesta inmune del hospedero para el control de patógenos.

A finales de la década de los ochenta comenzaron a emplearse inmunoestimulantes y probióticos en acuicultura, principalmente para aumentar la duración de la actividad de la respuesta inmunitaria inespecífica, que se caracteriza por tener un modo de acción generalizado (no actúan contra un microorganismo específico), por lo que tienen un uso profiláctico general (Rodríguez et al., 2003).

Dentro de los inmunoestimulantes se pueden encontrar: a) elementos estructurales de las bacterias (Lipopolisacáridos LPS, lipopéptidos, glicoproteínas capsulares y muramilpéptidos); b) productos de β-1,3/1,6 glucanos, provenientes de bacterias, hongos miceliales y levaduras; c) carbohidratos con estructuras complejas (glucanos) de varias fuentes biológicas incluyendo algas; péptidos presentes en extractos de ciertos animales o hechos por hidrólisis enzimática de proteínas de peces; nucleótidos y productos sintéticos; d) también se encuentran algunos alimentos poseedores de un efecto beneficioso sobre la salud (también conocidos como nutracéuticos) (Raa, 2000), vitaminas (C, E, A, D), carotenos, minerales (zinc, cobre, manganeso, cobalto, yodo, flúor, entre otros), que actúan principalmente como inmunomoduladores (Rondón, 2004); e) probióticos, definidos como microorganismos vivos que confieren un efecto fisiológico benéfico sobre el hospedero (Fuller, 1989), estos incluyen bacterias del genero Lactobacillus, Carnobacterium, Vibrio, Enterococcus, Bacillus, Leuconostoc, Lactacoccus, Pediococcus y Shewanella y levaduras como Saccharomyces cerevisiae entre otros (Verschuere, 2000).

Los primeros estudios sobre inmunomodulación de teleósteos se realizaron in vitro y, posteriormente, in vivo. In vivo estas sustancias pueden administrarse por inyección (técnica costosa que implica manipulación de los peces), o bien disueltas en el agua, es decir, mediante baño de los animales (que también implica manipulación y con ello, estrés). El modo más reciente de aplicación de inmunoestimulantes es a través de la dieta, lo que ofrece muchas ventajas ya que resulta menos costoso y no implica manipulación de ejemplares (Rodríguez et al., 2003).

En la actualidad, se estudia su uso combinado con vacunas y antibióticos, así como el efecto de mezclas de inmunoestimulantes, evaluados a través de diferentes mecanismos de defensa inespecíficos; sin embargo, muchas veces los resultados son difíciles de evaluar y no ha sido fácil identificar un biomarcador efectivo para la resistencia a enfermedades en peces. Aoshima et al. (2005) (citado por Rodríguez et al., 2003), plantearon que un incremento en las respuestas de defensa no específicas in vitro no siempre reflejan el incremento de resistencia a la enfermedad, por tanto, las respuestas integradas adecuadas de varios mecanismos deben ser probadas con un desafío artificial estandarizado con un agente infeccioso. Así, la mayoría de reportes han descrito la resistencia a infecciones bacterianas principalmente en los desafíos de enfermedad (Nakagawa, 2007).

Dentro de los inmunoestimulantes más comúnmente utilizados en peces, se encuentran los β-glucanos (principalmente extraídos de la levadura Saccha- romyces cerevisiae), los probióticos, especialmente el grupo de bacterias acido lácticas y lipopolisacáridos.

Reconocimiento de los inmunoestimulantes

Los inmunoestimulantes se caracterizan por tener repeticiones de ciertas moléculas (tales como glucosa, ribosa, ácidos grasos, ciertas lipoproteínas, entre otras) que son estructuras abundantes y conservadas en comunidades microbianas de procariotas (Dalmo y Bøgwald, 2008), y están ausentes o difieren en estructura de las células eucariotas, tales estructuras son denominadas: Patrones Moleculares Asociados a Microorganismos (MAMPs) y en el caso de los microorganismos que inducen enfermedad son denominados Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PAMPs) (estructuras encontradas también en microorganismos potencialmente patógenos) (Patiño, 2009).

Los PAMPs son capaces de unirse a receptores de células centinelas, como macrófagos, células dendríticas, células mast (para el caso de mamíferos) o granulares eosinofílicas para el caso de los peces. La unión de los PAMPs a los receptores, activa vías de señalización intracelular y causa que las células centinelas secreten moléculas que disparan la respuesta inmune (Tizard, 2009).

β-glucanos

Estructura de β-glucanos

El nombre de los β-glucanos proviene del prefijo Gluc, que significa poliglucosa y an, que es sufijo para (homopolisacáridos), β (1,3)-D glucanos, es el termino más común para los homopolisacáridos que tienen uniones β (1,3)-D en el esqueleto, y también pueden poseer uniones β-D glucosídicas en posición 6 (Dalmo y Bøgwald, 2008) (Figura 1).

En la naturaleza, los β-glucanos se encuentran en plantas, algas, bacterias, hongos y levaduras (Selvaraj et al., 2005a). Los β-glucanos de las levaduras son carbohidratos que consisten en glucosa y manosa como principales constituyentes de la membrana celular (Dalmo y Bøgwald, 2008; Mantovani et al., 2008).

Reconocimiento de β-glucanos

Se ha hipotetizado que la colaboración de diferentes familias de receptores, así como las opsoninas no clásicas y las cascadas de proteínas como el complemento, son importantes mecanismos para mejorar la afinidad la adhesión a los β-glucanos. (Dalmo y Bøgwald, 2008). Dentro de los receptores más importantes de este compuesto se encuentran los receptores scavengers, que son receptores no opsónicos de baja afinidad, que pueden unirse a varias sustancias polianiónicas, como los β-glucanos sulfatados, sin embargo estos receptores no se relacionan con la unión e internalización de este compuesto.

 

Figura 1. Estructura de β-glucanos de la pared celular de una levadura (Tomado de Volman et al., 2008).

 

Se he reportado que el principal receptor de β-glucanos, es la Dectina-1, este receptor pertenece a los receptores similares a la lectina tipo C, que se une principalmente a ligados proteicos (Dennhy et al., 2007), media la señalización que induce la producción de IL-10 y la explosión respiratoria en neutrófilos. La cooperación de la Dectina 1 y el TRL2, también inducen la producción de IFN-γ, IL-2 y IL-12p40 (Tada et al., 2009; Rothfuchs et al., 2007), y la diferenciación de células Th1. Estudios recientes sugieren que la Dectina-1 induce IL-17 para la producción de células Th17, tanto en humanos como en ratones (Palm y Medzhitov, 2007), en peces algunos de los genes inductores de IL-17, han sido clonados en zebrafish, trucha arco iris, y la lamprea (Gunimaladevi et al., 2006), y algunos están siendo clonados y caracterizados, como en Salmón de Atlántico (Dalmo y Bøgwald, 2008); en peces, la respuesta de estos genes es importante en la activación de células epiteliales, reclutamiento de neutrófilos, y para la migración de leucocitos hacia la mucosa por modulación de la expresión de receptores de quimioquinas. Otros receptores que pueden estar involucrados en la respuesta inducida por β-glucanos en peces puede ser la lactosilceramida, encontrado en leucocitos y células endoteliales, que induce la producción de especies reactivas de oxígeno (Chen, 2007), y los receptores de complemento tipo 3, de la familia de las β2-integrinas, que controlan la síntesis de IL-2 en monocitos de humanos y afectan la inmunidad de células T, aunque se ha revelado estudios de la formación del CR3 en carpas (Nakao et al., 2003), aun no se ha clonado los genes C3, en ningún pece hasta ahora (Dalmo y Bøgwald, 2008). Los receptores de β-glucanos se han encontrado en macrófagos de salmón del atlántico (Engstad et al., 1994) y neutrófilos del catfish (Ainsworth, 1994)

Efecto de β-glucanos en peces

Se ha demostrado que el reconocimiento de β-glucanos activa directamente los leucocitos, estimula la fagocitosis, la actividad citotóxica y antimicrobiana, incluyendo la producción de especies reactivas intermediarias de nitrógeno y oxígeno; adicionalmente, estos carbohidratos modulan la producción de mediadores proinflamatorios, citoquinas y quimioquinas, como IL-8 (Interleuquina-8), IL-1β, IL-6 y TNFα (Factor de necrosis tumoral alfa), otorgando una mejor y más rápida capacidad de respuesta, que repercute en una mayor resistencia a patógenos (Falco et al 2012; Carpang et al 2012; Refstie et al., 2012; Zhang et al., 2009; Kim y Zhang, 2009; Misra et al., 2006; Selvaraj et al., 2006).

En peces, se ha demostrado que el efecto de los β-glucanos varía con la especie de estudio, y depende de la cantidad incorporada en la dieta, la duración en la alimentación y temperatura ambiental. Los β-glucanos solubles pueden ser absorbidos por el intestino y por tanto ser nutritivos. Se ha demostrado su efecto en: inmunoestimulación de peces sanos, inmunoestimulación en peces inmunocomprometidos, inmunoestimulación por inyección (así como su efecto adyuvante), estimulación de la inmunidad adaptativa y su efecto junto a vacunas (Lin et al., 2011; El-Boshy et al., 2010; Kuntuu et al, 2009; Dalmo y Bøgwald, 2008; Selvaraj et al., 2006; Palic et al., 2006). Algunos de los estudios de inmunoestimulación por β-glucanos en peces, se resumen en la tabla 1.

Los β-glucanos, tienen el potencial de incrementar las tasas de supervivencia de peces, al menos al ser usado como medida profiláctica. Dietas con suplementos de β-glucanos son una opción interesante para mejorar la actividad defensiva y por tanto la resistencia a enfermedades, y su uso como adyuvante. Uno de los aspectos prometedores es su potencial para activar las células Th17 de los peces, que ofrece un incremento en la resistencia a enfermedades de la mucosa (Dalmo y Bøgwald, 2008).

Estructura de los LPS

Los lipopolisacáridos son componentes complejos de la membrana externa celular de bacterias Gram negativas, conocidos como endotoxinas. Generalmente son sustancias de gran peso molecular con una única estructura química, que consta de tres regiones: una región externa (conocida como antígeno O, componente lineal o ramificado de residuos de oligosacáridos), una región de polisacáridos del núcleo (que consiste en cadenas cortas de azúcares), y una región interna rica en ácidos (i.e. lípido A con unidades de diglucosamina con ácidos grasos de cadena larga) (Swain et al., 2008; Madigan et al., 2009) (Figura 2).

Los animales superiores son extremadamente sensibles a la endotoxina, incluso a dosis bajas, pero vertebrados inferiores como las ranas y los peces son resistentes al choque endotóxico (Berczi et al., 1966 citado por Swain et al., 2008).

Reconocimiento de LPS

En mamíferos, el TLR4 es el principal componente del complejo receptor (CD14/TLR4/MD2) (receptores CD14 y TLR4 asociados a proteína MD-2) que está relacionado con la activación del sistema inmune por LPS.

El LPS es capaz de unirse a la proteína de unión LBP (por sus siglas en inglés lipopolysaccharide binding protein), la unión se hace específicamente a través de la estructura endotóxica del LPS denominada lípido A; esta unión a su vez acelera la unión de la endotoxina al receptor CD14 que actúa junto con el complejo TLR4/MD2, resultando en la homodimerización y activación del TLR4 seguido del reclutamiento de las moléculas adaptadoras intracelulares (dentro de las cuáles participan la MyD88, TIRAP, TICAM 1 y TICAM 2), a través de sus dominios TIR, que por último permite la expresión de genes proinflamatorios (Fitzgerald et al., 2004).

 

Figura 2. Unidad típica de polisacárido mostrando las diferentes regiones. (Modificado de Swain et al., 2008).

 

Tabla 1. Estudios de β-glucanos como inmunoestimulantes en peces

Inmunoestimulantes en teleosteos: Probióticos, β-glucanos y LPS 51

 

 

Sin embargo, según Iliev et al. (2005), el complejo CD14/ TLR4/MD2 en peces está ausente, así como la LBP y la proteína adaptadora TICAM2, por lo que se explicaría la atenuada sensibilidad a los LPS en peces. Adicionalmente Novoa et al. (2009), reportó la tolerancia a LPS de larvas de zebrafish (entendiendo la tolerancia como una hiporespuesta a un segundo tratamiento de LPS luego de una primera exposición con dosis subletales de LPS), demostraron además que es este estado la producción de IL-1 disminuye, concordante con la respuesta de la inhibición de la expresión de TNFα, IL-1β, IL-6 y IL-12 en casos de tolerancia, adicionalmente reportaron que con larvas zebrafish Odysseus, mutantes del gen CXCR4, un receptor de quimioquina, o larvas silvestres tratadas con un inhibidor farmacéutico específico de CXCR4 expuestas a LPS, se obtenía una respuesta inflamatoria aguda y una reversión de la tolerancia a LPS, por lo que infirieron que el receptor CXCR4, es parte funcional del complejo sensible a los LPS y pudiese tener un papel en la inhibición de la cascada de señalización iniciada por TLR4. Sin embargo Sullivan et al., (2009), reporta que la falta de respuesta al LPS de E. coli coli y Legionella pneumophilia por parte del zebrafish es por la inhabilidad de TL-R4a y el TRL4b de reconocer la molécula, más que por cambios en la capacidad de traducir las señales a través del domino (TIR) del receptor Toll/IL-1 Adicionalmente, según Illiev et al. (2005) el reconocimiento de leucocitos a los LPS puede estar dado por otras proteínas de unión a membrana como la CD11/CD18, también conocidas como β-integrinas; las proteínas de choque térmico 70 (HSP70), HSP 90, receptores de quimioquina, receptor CXCR4 y el factor de diferenciación 5 (GDF5). Las β-integrinas reconocen la estructuras hidrofílicas expuestas al ambiente de los carbohidratos de los LPS, no la parte hidrofóbica endotóxica (como es el caso de la LBP). Olive et al. (2005), hipotetízan la posibilidad que diferentes receptores, incluyendo TLRs, estén relacionados en la activación de los fagocitos mononucleares de peces, a través de las interacciones colaterales con las β-integrinas y la subsecuente transmisión de señales de activación intracelular (Figura 3).

Efecto de LPS en peces

Los LPS pueden disparar varios componentes inmunes en peces, así como mejorar su sobrevivencia (Swain et al., 2008). Se ha reportado inducción leve de TNF-2 (factor de necrosis tumoral 2) en monocitos de Oncorhynchus mykiss (Iliev et al., 2005) con LPS de Escherichia coli, mejoramiento de la inmunidad y mejoramiento de la sobrevivencia inmunizando carpas comunes con LPS de A. hydrophila (Selvaraj et al., 2006). En la tabla 2, se resumen algunos de los trabajos en peces y su efecto sobre componentes inmunes, la tabla 3 presenta trabajos del uso combinado de LPS y β-glucanos.

Figura 3.Esquema de las diferencias en entre peces y mamíferos a la respuesta por LPS (Modificado de Iliev et al., 2005).

 

Bacterias probióticas

La FAO/WHO (2001), define los probióticos como: microorganismos vivos que confieren un efecto fisiológico benéfico sobre el hospedero cuando se administran en cantidades adecuadas. Estos microorganismos son capaces de modular muchos aspectos principalmente los asociados al sistema inmune innato. La mayoría de las bacterias probióticas propuestas para el uso en acuicultura pertenecen a los géneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Carnobacterium, Shewanella, Bacillus, Aeromonas, Vibrio, Enterobacter, Pseudomonas, Clostridium, y Saccharomyces (Nayak, 2010).

El género Lactobacillus ha sido uno de los géneros más estudiados y más utilizados como probióticos, son generalmente reconocidas como seguros (GRAS por sus siglas en inglés Generally Recognized as Safe), pertenecen a la microbiota comensal gastrointestinal de humanos y animales, y se encuentra normalmente en alimentos fermentados junto con otras bacterias ácido lácticas (bacterias Gram positivas que producen ácido láctico como único (homofermentativas) o principal producto (heterofermentativas) de la fermentación de azucares (Kekkonen, 2008; Madigan, 2009). Por estas características la presente revisión se centra en el uso de Lactobacullis como probiótico en peces.

 

Tabla 2.Estudios de efectos in vivo de LPS en peces (modificado de Swain et al., 2008)

 

En Colombia, se han desarrollado pocos trabajos en el área. En 2004, se reportó por primera vez la utilización de microorganismos en la dieta de peces, en donde se evaluó el efecto de la inclusión de bacterias probióticas (Lactobacillus acidophillus y Bacillus subtilis) y prebióticos (pared de Saccharomyces cerevisiae) en la dieta para la alimentación de alevinos de cachama blanca (Piaractus brachypomus), como promotores del crecimiento (Pérez et al., 2004). Más recientemente, se reportó un mejoramiento de la tasa de conversión alimenticia, tasa de crecimiento específico e incremento diario de peso en tilapias nilóticas alimentadas con Bacillus y Lactobacillus (Martínez et al., 2008a), adicionalmente los autores revelaron antagonismo in vitro de Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophilus contra dos patógenos de peces Streptococcus agalactiae y Aeromonas hydrophila, paralelamente realizaron ensayos in vivo, donde se demostró mayor sobrevivencia de peces alimentados con Bacillus sp., y Lactobacillus casei y desafiados a estos patógenos (Martínez et al., 2008b). Sin embargo, a pesar de los resultados favorables, tanto en productividad como sobre el estado de salud de los peces, la investigación en esta área es aún muy incipiente en el país, limitando su uso y aplicación tecnológica que favorecería la productividad de los sistemas piscícolas en Colombia.

Mecanismo de acción y efecto en peces

os probióticos ha mostrado modular la composición y el metabolismo de la microbiota comensal, la competencia con patógenos incluyendo la inhibición o bloqueo de su adhesión, e inducir la producción de mucina, adicionalmente es capaz de producir compuestos antimicrobianos, como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, ácidos grasos de cadena corta y bacteriocinas que refuerzan la barrera intestinal, ayudan a la regeneración de células epiteliales y al reforzamiento de las uniones estrechas de los enterocitos e incrementan los niveles de linfocitos intraepiteliales y granulocitos acidófilos en la mucosa (Pirarat et al., 2011; Kekkonen, 2008; Vásquez et al., 2005). En el caso de los peces alimentados con Lactobacillus sp., se ha demostrado protección contra las enfermedades infecciosas de los peces, tales como las causadas por la enfermedad del virus linfocitico (LCDV), S. iniae, S. parauberis, A. hydrophila, A. salmonicida, Edwardsiella tarda y Vibrio anguillarum, (Harikrishnan et al., 2010a; Harikrishnan et al., 2010b; Aly et al., 2008; El-Boshy et al., 2010; Balcázar et al., 2006, Nopadon, et al., 2006; Taoka et al., 2006; Kim y Austin, 2006; Nopadon et al., 2006); colonización del intestino por periodos de tiempo en que se suministra el probiótico y después de hasta tres semanas y cuatro semanas (Son et al., 2009; Kim y Austin, 2006; Chang y Liu, 2002); mejoramiento de la respuesta inmune, incrementando la expresión de genes proinflamatorios y antiinflamatorios (Falco et al., 2012; Carpang et al., 2012); la expresión de receptores en la mucosa que disparan la respuesta inmune innata (Maldonado et al., 2007), el incremento de la actividad fagocítica, actividad del complemento, explosión respiratoria, expresión de citoquinas, actividad de la lisozima, actividad citotóxica de leucocitos (Falco et al., 2012; Carpang et al., 2012; El-Boshy et al., 2010; Kuntuu et al., 2009; Son et al., 2009; Harikrishana et al., 2010 a y b; Harikrishana et al., 2011 a y b; Wang et al., 2008; Panigrahi et al., 2007; Balcázar et al., 2006), e interferencia del Quorum sensing de bacterias (Nguyen et al., 2008), que se refiere al mecanismo por el cual los miembros de una población bacteriana se comportan cooperativamente, como respuesta a la densidad de la población. Adicionalmente, algunos trabajos se han enfocado en el uso de probióticos para el mejoramiento de parámetros productivos como ganancia de peso, eficiencia de retención de proteína, entre otros, asociando estas propiedades a la actividad de enzimas de las bacterias, que mejoran la utilización de nutrientes en los peces (Saha et al., 2006; Haroun et al., 2006; Yanbo y Zirong, 2006; Wang et al., 2008).

 

Tabla 3. Estudio in vivo del efecto de mezclas de componentes microbianos, administrados por diferentes vías

 

La tabla 4 resume algunos de los trabajos recientes realizados probióticos y su efecto tanto in vitro como in vivo en peces de cultivo.

Algunas hipótesis involucradas en los mecanismos de acción de los probióticos sobre el sistema inmune de peces

Además de los mecanismos anteriormente descritos de protección al hospedero por acción de los probióticos, se hipotetiza que existen mecanismos alternativos que pueden estar influyendo la respuesta inmune del hospedero.

Células de Paneth/CGE. La respuesta inmune en el intestino depende en gran parte de la presencia de células (ej. células caliciformes, células Paneth) especializadas en la producción de moléculas con funciones inmunes (criptidinas o α/β-defensinas) o implicadas en la renovación del epitelio intestinal o de la expresión de moléculas de superficie, incluyendo lectinas (Keshav, 2006); aunque no existen células Paneth descritas en peces, Sveinbjørnsson et al., (1996) describieron las células granulares eosinofílicas/células mast (CGE/CM) como análogas a las células de Paneth de los mamíferos, dada su secreción de lisozima así como su localización asociada al tracto gastrointestinal (Fawcett, 1987) y la capacidad de regenerar sus gránulos (Sveinbjørnsson, 1996; Rumio et al., 2004). Así como las células Paneth en mamíferos, sus análogas, las CGE en peces han guiado a la hipótesis de que estas podrían reconocer las bacterias probióticas que ingresan a la cripta, a través del TLR9 localizado en los gránulos secretorios, permitiendo la liberación de sustancias antimicrobianas.

Adicionalmente, se ha demostrado que ciertas células epiteliales activan genes que codifican defensinas, (moléculas descritas en peces, específicamente defensinas β), (Zou et al., 2007 y Falco et al., 2008) o expresan matrilisina en respuesta al contacto con bacterias (Rumio et al., 2004; López-Boado et al., 2000), las defensinas pueden tener actividad antiviral, probablemente por inducción del interferón tipo I, y tener propiedades quimiotácticas para las células dendríticas (Keshav, 2006), de esta manera median respuestas inflamatorias y el reclutamiento celular en la mucosa, como lo observado en peces alimentados con cepas de Lactabacillus sp., en donde se incrementa la población de linfocitos intraepiteliales y granulocitos en la mucosa intestinal (Pirarat et al., 2011; Picchietti et al., 2009), de tal forma que, tanto la posible función de las CGE como la estimulación para la producción de β-defensinas, pueden estar involucrados dentro de los mecanismos de inmunomodulación por bacterias acido lácticas en peces.

Fucosilación. Por otra parte, se ha demostrado que los glicoconjugados juegan un papel clave en las interacciones célula blanco-patógeno por un lado y en la protección de las células epiteliales por otro a través de un glicocalix altamente glicosilado (Lelouard et al., 1999; Ma et al., 2006; Sharon, 2006). Umeaski y Ohara (1989) demostraron que la actividad de la glicolípido fucosil-transferasa fue inducida por la introducción de bacterias en el tracto intestinal de animales axénicos.

Tabla 4. Estudios de Lactobacillus como probióticos en peces

Aparentemente, dos programas de diferenciación toman lugar durante la diferenciación en las criptas. Esto guía a la expresión de diferentes glicosil-transferasas o acetil transferasas las cuales participan en la síntesis de ambientes glicosídicos en el borde libre en cepillo de los enterocitos (Maury et al., 1995) y dicho proceso puede ser dependiente del contenido de fibra en la dieta (Tardy et al., 1995).

Trabajos de Matsumura et al. (1999) describen proteínas similares a lectinas en cepas probióticas, las cuales contribuyen a la adherencia a la mucosa del intestino del hospedero. Se sugiere que algunas de estas proteínas similares a lectina reconocen la estructura de carbohidratos interna más que la estructura de carbohidratos externa (L-Fucosa, N- acetil D- Galac- tosamina y acido N-acetil murámico).

Freitas et al. (2003) han descrito que la modulación por parte de las bacterias de la fucosilación (incremento en la producción de L-fucosa) de la superficie de los enterocitos permite un control de otras poblaciones bacterianas. Además, se ha demostrado que el intercambio de señales cruzadas del epitelio y las bacterias permite la regulación en la secreción de matrilisina, una metaloproteasa relacionada con el control de las pro-defensinas. Se ha demostrado que algunas bacterias, como Bacterioides thetaiotaomicron, son capaces de incrementar específicamente la galactosilación de las células epiteliales, sin embargo el patrón de expresión es especifico a la bacteria, siendo así que la exposición a Lactobacillus casei, incrementó la expresión de galactosa y ácido siálico y disminuyó la de la N-acetil glucosamina (Freitas et al., 2003). Dicha glicosilación puede tener un papel importante en limitar la entrada de virus intestinales. Recientemente, Irie et al. (2004) demostraron que algunos glicoesfingolípidos como Galactosil-β1 ceramida, son capaces de reconocer y unirse a bacterias como V. anguillarum, siendo reconocido como receptor para la adhesión de esta bacteria al intestino de la trucha arcoiris (Figura 4).

Conclusiones y perspectivas

El uso de inmunoestimulantes en piscicultura posee un gran potencial como herramienta preventiva y de manejo sanitario. Han despertado gran interés por tener un modo de acción generalizado, capaces de aumentar la respuesta inmunitaria específica, respondiendo ante varios microorganismos patógenos y pudiéndose utilizar de manera profiláctica. Sin embargo, actualmente, el sector productivo piscícola colombiano se encuentra ante una gran oferta de sustancias o productos para mejorar las condiciones sanitarias, esto sin respaldo técnico ni rigor científico.

 

Figura 4. Esquema propuesto del mecanismo de acción de los probióticos en peces. 1) Las L AB (verdes) son capaces de actuar sobre las potencialmente patógenas (violetas) mediante la secreción de enzimas y algunos péptidos (e.g. bacteriocinas); 2) las L AB pueden competir por sitios de adhesión celular de los enterocitos; 3) tanto L AB como patógenas son reconocidas primariamente por los receptores glicosídicos (L-fucosa; glicosilación) de la superficie de los enterocitos, en la mayoría de los casos estimulados por la acción de las modulinas secretadas por las L AB (3a); 4) además se ha demostrado que los enterocitos expresan TLR (TLR4) pudiendo hacer translocación bacteriana y reconociendo tanto bacterias patógenas como L AB, este reconocimiento genera una señal intracelular que culmina con la síntesis de citoquinas proinflamatorias que estimulan tanto células dendríticas así como otras células inmunes asociadas a las mucosas; 5) la existencia de células Paneth (?) o células granulares eosinofílicas asociadas al epitelio, las cuales pueden vertir sus secreciones al lumen; 6) así como expresar TLR (TLR9) y proteínas NOD para el reconocimiento de PAMPs bacterianos; 7) las células granulares eosinofílicas (células Paneth?) son capaces de secretar TNF-α que su vez estimulan a células dendríticas que pueden reclutar células como macrófagos. Esta estimulación vía TLR puede inducir la producción de interferón tipo I el cual tiene propiedades antivirales así como de otras citoquinas (IL-1, IL-6); 9) esta secreción pueden retroalimentar a los enterocitos induciendo la expresión de más receptores; por último, se hace necesario investigar la existencia de células M (10) en peces, lo que permitiría vislumbrar nuevos mecanismo de homeostasis intestinal.

 

Por esta razón, se hace necesaria la realización de trabajos de investigación tendientes a definir la respuesta que generan principalmente en el sistema inmune innato, para su uso profiláctico; estudios que se pueden extrapolar de estudios previos en especies similares adecuando metodologías para evaluación en condiciones locales, que puedan responder, por ejemplo, sobre cuáles serían las cantidades y tiempos adecuados de suministro para mantener la respuesta inmune apropiada, ya que se ha visto que el suministro permanente y dosis muy elevadas de sustancias inmunoestimulantes puede tener incluso efectos adversos sobre la salud de los peces; también, se requiere la realización de trabajos que pongan a prueba el grado de protección de las sustancias ante un patógeno determinado, a través de infecciones experimentales, evaluando la supervivencia de los peces como parámetro más acertado de la respuesta de todo el organismo en condiciones de campo. Adicionalmente, se deben tener en cuenta diferencias intraespecíficas de los peces dentro de los estudios, por lo cual, estos deben considerar cada una de las especies de interés.

Aunque existen en la actualidad gran cantidad de trabajos acerca del efecto benéfico de probióticos e inmunoestimulantes en el mundo, poco se ha hecho en Colombia, esto aunado a que varias sustancias inmunoestimulantes evaluadas con rigor científico, son de alto costo y difícil consecución debería motivar trabajos de investigación enfocadas al uso de sustancias y microrganismos que puedan extraerse y producirse localmente y de manera industrial sin afectar de forma importante los costos de producción, sustancias que puedan incluirse en el pienso para facilitar el proceso de asimilación sin manipulación y estrés de los animales; investigaciones rigurosas y confiables para emplearlos como estrategia preventiva viable para mejorar la respuesta inmune de los peces, reduciendo así, problemas sanitarios, ambientales y pérdidas económicas en los sistemas de cultivo regionales.

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