Articulo de Revisión /Review Article

Aproximaciones a la comprensión de la degradación de la lignina

Approaches to understanding lignin degradation

Martha L. Ortiz¹

¹Facultad de Ciencias Básicas e Ingeniería, Universidad de los Llanos. [email protected]

Recibido: Marzo 31 de 2009 Aceptado: Septiembre 17 de 2009

RESUMEN

El objetivo de esta revisión es reunir los hallazgos más recientes que aportan a la comprensión de las rutas metabólicas que intervienen en la degradación del biopolímero más recalcitrante del planeta: la lignina. Esta le proporcionó a las plantas resistencia mecánica en sus tejidos para colonizar la tierra y una barrera fisicoquímica ante la infección microbiana. Debido a su naturaleza recalcitrante, la lignina es el precursor principal para la síntesis de la reserva de materia orgánica del suelo, regulando el ciclo del carbono. Adicionalmente, el sistema enzimático extracelular inespecífico que usan los microorganismos para degradar la lignina, ofrece un sinnúmero de moléculas con potencial biotecnológico. Este trabajo pretende estimular la investigación en la degradación de lignina, especialmente en ambientes poco explorados como la Amazorinoquía para el desarrollo de la bioprospección en nuestro país.

Palabras clave: Lignina, enzimas, microorganismos, biotecnología.

ABSTRACT

This work was aimed at summarising our current knowledge regarding understanding the metabolic routes intervening in lignin degradation, this being the most recalcitrant biopolymer on earth. Lignin provides plant tissues with mechanic resistance for colonising the earth and represents a physicochemical barrier to microbial infection. Lignin is the main precursor for synthesising the reserve of soil organic matter due to its recalcitrant nature, thereby regulating the carbon cycle. The unspecific extracellular enzymatic system used by microorganisms for lignin degradation offers a large number of molecules having biotechnological potential. This work tries to stimulate research into lignin degradation, especially in little explored environments such as the Amazon-Orinoquía region for developing bioprospecting in Colombia.

Key words: Lignin, enzyme, microorganism, biotechnology.

INTRODUCCIÓN

La pared celular vegetal esta compuesta principalmente de polisacáridos como celulosa, hemicelulosa y pectina, que están unidos con proteínas y lignina, formando una estructura rígida y compleja. Se estima que aproximadamente 4 x 10⁹ton de celulosa y 0,8 x 10⁹ ton de lignina se producen anualmente en el planeta, sin embargo estos polímeros no se acumulan en la tierra debido a hongos y bacterias, que degradan eficientemente los componentes de la biomasa vegetal. Estos microorganismos tienen un rol clave en el reciclaje del carbono en los ecosistemas. La degradación de la biomasa vegetal es un proceso complejo que involucra la acción sinérgica de un gran número de enzimas extracelulares (Aro et al., 2005).

Estas enzimas no sólo participan en el ciclo del carbono, también se consideran como factores de virulencia en microorganismos fitopatógenos, los cuáles son activados por señales ambientales y de quórum sensing (Dong et al., 2000). Las enzimas degradadoras de polisacáridos adicionalmente, determinan la capacidad de ataque de los hongos micoparasíticos, al permitirles hidrolizar la pared celular de su fitopatógeno fúngico blanco (Inglis & Kawchuk, 2002).

Muchas de las enzimas degradadoras de biomasa vegetal han recibido considerable atención por sus potenciales aplicaciones en las industrias de alimentos, concentrados, agropecuarias, textiles, del papel y petrolera (Buchert et al., 1998; van Wyk, J., 2001; de Vries et al., 2002; Penttilä, et al., 2003; Lynd et al., 2005; Couto & Sanromán, 2005).

Es de destacar que la importancia de los hongos en el ciclo del carbono y biotecnológica como vehículos de sobreexpresión de enzimas de interés industrial, han promovido el interés en la comprensión de la producción de las enzimas extracelulares lignocelulolíticas. Los hongos filamentosos más estudiados con respecto a sus enzimas degradadoras de biomasa vegetal son Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Penicillium sp y el basidiomiceto lignolítico Phanerochaete chrysosporium.

LOS POLISACÁRIDOS DE LA PARED CELULAR VEGETAL Y LA LIGNINA

La pared celular vegetal contiene celulosa, hemicelulosa, pectina y el polímero fenólico lignina. La Celulosa es el polisacárido más abundante en la naturaleza y el principal constituyente de la pared celular vegetal proveyéndole rigidez. La Celulosa esta formada por unidades de D-glucosa unidas por enlaces b 1-4 que forman cadenas poliméricas lineares de aproximadamente 8000-12000 unidades de glucosa (Alexander, 1967).

Las hemicelulosas, son los segundos polímeros en importancia, tienen una composición heterogénea de varios tipos de unidades de azúcar. Las hemicelulosas son usualmente clasificadas de acuerdo al residuo de azúcar principal en la estructura del polímero. Las más importantes son el xilan, encontrado en diferentes tipos de plantas y el (galacto)glucomanano de las maderas, están formados por D-xilosas o D-manosas unidas por enlaces b 1-4, respectivamente. Las hemicelulosas menos frecuentes son el arabinano formado por unidades de L-arabinosa con enlaces a 1-5 y galactano que posee unidades de D-galactosa asociadas por enlaces b 1-3. La cadena principal de azucares de las hemicelulosas es modificada por varios grupos sustituyentes como el ácido 4-O- metilglucorónico, arabinosa, galactosa y acetil, haciendo a las hemicelulosas ramificadas y con estructura variable (Timell, 1967; Wilkie, 1979).

Las pectinas son una familia de polisacáridos complejos que contiene unidades de ácido D-galacturonico unidas por enlaces a 1-4. Las pectinas contienen dos diferentes tipos de regiones, de acuerdo a su apariencia en las microfotografías electrónicas. En la región "lisa" de la pectina, hay residuos de ácido D-galacturónico metillados o acetilados, mientras que en la región "ramificada" hay D-xilosa sustituida con galacturano y ramnogalacturano, las cadenas de arabinano y galactano se unen por los residuos de ramnosa (Aro et al., 2005).

La pared de celulosa es reforzada por la lignina, un polímero insoluble, complejo y ramificado de unidades fenilpropano sustituidas, las cuáles se unen por enlaces éter o carbono-carbono formando una extensa red dentro de la pared celular vegetal, estos enlaces hacen que sea un polímero recalcitrante. Este polímero es el producto de la condensación de varias moléculas y no es formado por una vía enzimática, lo cual determina que su estructura sea altamente variable, dependiendo el tipo de planta, su estado fenológico y tasa fotosintética (Leonowicz et al., 1999).

 

ENZIMAS INVOLUCRADAS EN LA DEGRADACIÓN DE LA LIGNINA: LIGNINASAS

En la pared celular vegetal, la lignina forma una matriz que envuelve a la celulosa y hemicelulosa. La degradación de lignina es un prerrequisito para la hidrólisis de los demás componentes de la biomasa vegetal, los cuáles son la principal fuente de carbono y energía para los microorganismos. Sin embargo, la hidrofobicidad, la estructura aleatoria, compleja y carente de enlaces hidrolizables comunes, hacen de la lignina resistente a la degradación, por parte de la mayoría de microorganismos degradadores de celulosa.

Las enzimas que degradan la lignina son oxidativas, inespecíficas y actúa vía mediadores no-proteicos en contraste con las celulasas y hemicelulasas hidrolíticas. Las principales enzimas lignolíticas son las manganeso peroxidasas (MnP), Lignin peroxidasas (LiP) que catalizan una variedad de reacciones oxidativas que son dependientes de H₂O₂, y las laccasas que oxidan compuestos fenólicos reduciendo el oxigeno molecular a agua. Adicional a estas también participan enzimas generadoras de peróxido de hidrógeno extracelular como la glioxal oxidasa y la glucosa2oxidasa que generan peróxido esencial para el funcionamiento de las peroxidasas.

Desde la clonación del primer gen lip codificante para una lignina peroxidasa de P.chyrsosporium por Tien & Tu (1987), varios genes lip han sido caracterizados en P. chrysosporium (Gaskell, et al. , 1994; Gold & Alic, 1993), como también en otros basidiomicetos como T. versicolor, P. radiata, Bjerkandera sp., y Pleurotus sp (Black & Reddy, 1991; Jonsson et al., 1994; Saloheimo et al., 1989; Kimura et al., 1991; Ruiz-Duenas et al., 1999). Comparados a los genes lip, el número de genes caracterizados que codifica para manganeso peroxidasas es pequeño (Lobos et al., 1998; Alic et al., 1997; Li et al., 1999). Los genes lignolíticos en basidiomicetos, generalmente están organizados en clusters en los genomas fúngicos como es el caso para los dos lip y gen de manganeso peroxidasa mnp, de T. versicolor (Johansson & Nyman, 1996).

EXPRESIÓN DE LIGNINASAS

La regulación de los genes codificantes para las enzimas lignolíticas ha sido estudiada a nivel del mRNA principalmente en Phanerochaete chrysosporium. Estudios en la expresión de los genes de la manganeso peroxidasa (mnp ) y lignin peroxidasa (lip o LIG) son complicados por el hecho de que la mayoría hongos lignolíticos posee varios genes lip y mnp, cercanamente relacionados pero regulados de forma diferente. Por ejemplo, P. chrysosporium tiene al menos 10 genes lip designados desde lip A hasta lip J (Gaskell et al., 1994) y tres genes mnp, mnp1 a mnp3 (Alic et al., 1997; Mayfield et al., 1994; Godfrey et al., 1990).

Además del alto número de genes homólogos lip, mnp y laccasa encontrados en hongos lignolíticos; el estudio de la expresión de los genes de codificantes para laccasas por métodos tradicionales como el análisis Northern blot es problemático, debido a las dificultades para la selección de sondas específicas replicables. La técnica de transcripción reversa acoplada a PCR (RT-PCR) recientemente ha sido usada para estudios cuantitativos de la expresión de genes lignolíticos, bajo diferentes condiciones ambientales. Sin embargo, la replicabilidad de esta técnica como método cuantitativo es controversial (Freeman et al., 1999).

En general, la expresión de genes lignolíticos es activada por la disminución de nutrientes como el nitrógeno, carbono o azufre y es por ende una respuesta de estrés ante carencias nutricionales. En P. chrysosporium, la expresión del gen mnp es activada por la ausencia de nitrógeno en el cultivo (Gold & Alic, 1993; Li et al., 1994)

También la presencia de Mn(II) en el medio de cultivo activa la expresión de mnp (Brown et al. , 1990; Brown et al., 1991; Gold & Alic, 1993; Gettemy et al., 1998). La presencia de posibles elementos de respuesta metálicos, ha sido reportada en los promotores de la manganeso peroxidasa (Brown et al., 1991; Gold & Alic, 1993; Gettemy et al., 1998).

La expresión de mnp es también inducida por el choque térmico en condiciones de carencia en nitrógeno y se han encontrado secuencias del elemento consenso de choque térmico (CN₂GAAN₂ TTCN2G) en los promotores de genes mnp (Godfrey et al., 1990; Mayfield et al., 1994). Además, la adición de H₂ O₂ y otras sustancias que participan en el estrés celular, también inducen la expresión de mnp in P. chrysosporium (Li et al., 1995).Al parecer la regulación de los genes mnp ocurre al menos en dos vías diferentes: el choque térmico y la inducción causada por los factores de estrés que sólo se da en cultivos limitados en nitrógeno, dependiente de la presencia de Mn(II). De igual manera los genes lip de P. chrysosporium son regulados de varias maneras, por ejemplo la respuesta a la deficiencia de nitrógeno y carbono (Stewart et al., 1992; Broda et al., 1995; Stewart & Cullen, 1999).

La expresión de los genes codificantes para laccasas no es dependiente de la limitación nutricional. Las laccasas son expresadas de forma constitutiva en los hongos basidiomicetos (Eggert et al., 1996; Smith et al., 1998; Scheel et al., 2000). Esta expresión constitutiva puede ser aumentada por inductores. Se ha reportado el aumento en la transcripción de la laccasa en respuesta a compuestos aromáticos como la 2,5-xilidina, para T. versicolor (Collins & Dobson, 1997), Trametes villosa (Yaver et al., 1996) y Agaricus bisporus (Smith et al., 1998). Se ha postulado que las laccasas, de expresión constitutiva, son las primeras enzimas degradadoras de lignina y que sus productos enzimáticos son inductores para el aumento de la síntesis de laccasas y la expresión de otros genes lignolíticos (Scheel et al., 2000). Los factores de transcripción reguladores de los genes codificantes de enzimas involucradas en la degradación de lignina aún no han sido descritos.

 

ROL DE LOS HONGOS Y BACTERIAS COMO DEGRADADORES DE LIGNINA

La lignina esta presente en las plantas terrestres y les da la rigidez estructural necesaria para la colonización del ambiente terrestre (Fengel, D., 1971; Ewbank et al., 1996). A pesar de su amplia distribución y temprana aparición en la vida terrestre, su descomposición es realizada por un número restringido de microorganismos, principalmente hongos y dentro de estos se destacan los Basidiomicetos que debido a su capacidad para mineralizar la lignina, se les denomina hongos de la podredumbre blanca (Rayner & Boddy, 1988; Worrall et al., 1997; Leonowicz et al., 1999; Tuomela et al., 2000). La degradación de la lignina sólo ocurre bajo condiciones aeróbicas.

La actividad lignolítica bacteriana es despreciable en ambientes terrestres, comparada con la de los hongos de la podredumbre blanca (Leonowicz et al., 1999; Kirk & Farrell, 1987). Sin embargo, el crecimiento de bacterias filamentosas y no filamentosas en compuestos similares a la lignina ha sido reportada (Céspedes et al., 1997; Falcón et al. , 1995; Vicuña et al., 1993; Peng et al., 2002). Varias especies de actinomicetos pueden solubilizar lignina, en particular la lignina de los pastos (Tuomela et al., 2000; Trigo & Ball, 1994). Ellos pueden utilizar una estrategia similar a la de los hongos de la podredumbre parda (es decir los que hacen oxidación parcial de la lignina), para ganar acceso a la celulosa (Tuor et al., 1995; Leonowicz et al., 1999; Lynd et al., 2002).

Los hongos que causan la podredumbre parda, generalmente hongos filamentosos, producen finas hifas de penetración que les dan acceso a la segunda capa lignificada de la pared celular, formando cadenas de cavidades en forma de diamante alrededor de la hifa y que siguen la orientación de las microfibras de celulosa (Rayner & Boddy, 1988; Daniel & Nilsson, 1998).

Los hongos que causan la podredumbre parda oxidan parcialmente la lignina dentro de una extensión limitada alrededor de la hifa. La degradación de la celulosa implica la participación de enzimas hidrolíticas y una reducción del pH del medio (por la liberación de oxalato) y la excreción de glicopeptidos de bajo peso molecular que contienen hierro, adicional a la generación de peróxido de hidrógeno. Los radicales libres son producidos por la reacción de Fenton, reduciendo el Fe(II) a Fe(III), y presumiblemente difunden libremente en la segunda capa lignificada de la pared celular, donde participan en la depolimerización de la lignina (Goodell, 2003).

PERSPECTIVAS

La capacidad de los hongos filamentosos para degradar de manera eficiente polímeros vegetales es una característica importante que provee un tópico interesante para los estudios concernientes a la ecología microbiana y los mecanismos básicos de la regulación nutricional, también ofrece un sinnúmero de posibles aplicaciones industriales.

Para lograr llegar al establecimiento de procesos biotecnológicos, es necesario comprender a) como las enzimas lignocelulíticas producen a partir de sus sustratos, compuestos como los azúcares oligoméricos y monoméricos, ácidos y sustancias fenólicas, b) las señales intracelulares regulatorias de la expresión de las enzimas degradadoras de polímeros de origen vegetal y c) las respuestas metabólicas que estos compuestos provocan en los hongos.

Adicionalmente, se requiere evaluar como funcionan las rutas metabólicas en diferentes especies fúngicas con distintos roles ecológicos como los anaeróbicos ruminales, los saprofitos del suelo y los fitopatógenos altamente especializados, especialmente en ecosistemas microbianos poco estudiados como los de laAmazonía y Orinoquía.

Por otro lado, se deben diseñar experimentos que sean más representativos del papel ecológico de los hongos degradadores de lignina utilizando mezclas de sustratos, inductores e inclusive de cepas, para obtener paquetes biotecnológicos a la medida de la industria.

Las técnicas de biología molecular y celular fúngica se han desarrollado rápidamente en los últimos 15 años. Sin embargo, la mayoría de técnicas aún siguen siendo complejas y dispendiosas con respecto a las de otros microorganismos, por lo tanto es menester de los investigadores perfeccionar estas técnicas para ponerlas al alcance de los ecólogos microbianos del mundo.

El número de genomas completamente secuenciados aumentará rápidamente en los próximos años, lo cuál permitirá disponer de información para realizar genómica comparativa y así dilucidar la estructura de las vías bioquímicas regulatorias involucradas en la degradación de la biomasa vegetal.

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