ARTÍCULO ORIGINAL/ORIGINAL ARTICLE

Concentración letal 50 a 96 horas de eugenol en cachama blanca (Piaractus brachypomus)

Lethal (96hLC50) concentration of eugenol in the Red-bellied Pacu (Piaractus brachypomus)

Concentração letal 50 a 96 horas de eugenol em cachama branca (Piaractus brachypomus)

Gira A. Marín - Mendez¹, Anyi Torres - Cortes¹, Leidy Naranjo -Suarez¹, Roberto A. Chacón - Novoa¹, Iang S. Rondón – Barragan^2*

¹ Est MVZ Universidad del Tolima, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia – Departamento de Sanidad Animal

^2* MVZ, MSc, Grupo de Investigación en Inmunología y Fisiopatología Animal – IFA; Tolima, Colombia. Email: [email protected]

Recibido: julio 29 de 2011 Aceptado: julio 11 de 2012

Resumen

El uso de anestésicos en peces ha adquirido una mayor relevancia debido al rol que desempeñan en el desarrollo de buenas prácticas de manejo, así como en la disminución de los niveles de estrés por manipulación tanto en explotaciones dedicadas a la producción de peces ornamentales como de consumo Existen anestésicos convencionales implementados en peces tales como 2-fenoxietanol, Benzocaína, Quinaldina y MS222 No obstante, su costo y margen de seguridad en ocasiones limitan su uso Por este motivo se requieren nuevos compuestos para el manejo adecuado de los peces, que garanticen su seguridad El objetivo de esta investigación fue establecer la concentración letal 50 (CL₅₀) a 96 horas del eugenol (aceite de clavo derivado de Eugenia caryophyllata) en cachama blanca Para la determinación de la CL₅₀ se utilizaron 90 alevinos de cachama blanca (Piaractus brachypomus) de 3.5 ± 0 5 g en acuarios de vidrio con un volumen cercano a los 30 litros, los parámetros de calidad del agua estuvieron dentro del rango confort para la especie Los peces fueron expuestos a siete concentraciones de eugenol (8, 12, 15, 18, 25, 35, 45 mg/L) adicionalmente se evalúo un grupo control y un grupo con el diluyente anestésico por un periodo de 96 horas, en el cual se evaluó su comportamiento: eje de nado, tipo de nado y distribución en el acuario El valor de la CL₅₀ se estimó mediante el uso del software Trimmed Spearman-Karber y fue de 18.2 mg/L (p<0.05), acorde a lo descrito para algunas especies dulceacuícolas.

Palabras clave: anestesia, cachama blanca, CL₅₀, eugenol

Abstract

Anaesthetic use in fish-farming has gained in significance due to its role in good handling practice, as well as decreased stress levels when handling both ornamental fish and fish for human consumption Conventional anaesthetics have been used in fish, such as 2-phenoxyethanol, benzocaine, quinaldine and tricaine me thanesulphonate (MS-222); nevertheless, the ir cost and safety margin have limited their use New and safe compounds are required for suitable, safe fish handling This study was aimed at determining the 96-hour 50% lethal concentration (96hLC50₅₀) of eugenol (Eugenia caryophyllata - derived clove oil) in Red-bellied Pacu Ninety Red-bellied Pacu (Piaractus brachypomus) alevins weighing 3 5 ± 0 5 g body weight were used for assessing LC₅₀; they were placed in 30-L glass aquariums where water quality came within the range of comfort for this specie The fish were exposed to seven concentrations of eugenol (8, 12, 15, 18, 25, 35, 45 mg/L) for a 96-h period, as well as a control group and another group with solvent anaesthetic, during which the fishes’ behaviour regarding their swimming axis, type of swimming and distribution in the aquarium was assessed The LC₅₀ value was calculated by using Trimmed Spearman-Karber (TSK) software, giving 18. 2 mg/L (p<0 05), thereby agreeing with reports regarding other freshwater fish species.

Keywords: anaesthesia, Red-bellied Pacu, LC₅₀, eugenol

Resumo

O uso de anestésicos em peixes adquiriu uma maior relevância devido ao papel que desempenham no desenvolvimento de boas práticas de manejo, bem como na diminuição dos níveis de estresse por manipulação tanto em explorações dedicadas à produção de peixes ornamentales como de consumo Existem anestésicos convencionais implementados em peixes tais como 2-fenoxietanol, Benzocaína, Quinaldina e MS222 Não obstante, seu custo e margem de segurança em ocasiões limitam seu uso Por este motivo se requerem novos compostos para o manejo adequado dos peixes, que garantam sua segurança O objetivo desta investigação foi estabelecer a concentração letal 50 (CL₅₀) a 96 horas do eugenol (azeite de prego derivado de Eugenia caryophyllata) em cachama branca Para a determinação da CL₅₀ se utilizaram 90 alevinos de cachama branca (Piaractus brachypomus) de 3 5 ± 0 5 g em aquários de vidro com um volume próximo aos 30 litros, os parâmetros de qualidade do água estiveram dentro da casta conforto para a espécie Os peixes foram expostos a sete concentrações de eugenol (8, 12, 15, 18, 25, 35, 45 mg/L) adicionalmente se avalio um grupo controle e um grupo com o diluyente anestésico por um período de 96 horas, no qual se avaliou seu comportamento: eixo de nado, tipo de nado e distribuição no aquário O valor da CL₅₀ se estimou mediante o uso do software Trimmed Spearman-Karber e foi de 18 2 mg/L (p<0 05), conforme ao descrito para algumas espécies dulceacuícolas.

Palavras- chave: anestesia, cachama branca, CL₅₀, eugenol.

Introducción

Los anestésicos desempeñan un papel importante en acuicultura al ser empleados para la realización de procedimientos médicos, quirúrgicos y experimentales, incluyendo la morfometría en peces (Hajek et al 2006) Este tipo de prácticas generan alteraciones en el desempeño fisiológico y productivo de los animales debido a una elevación en los niveles de estrés que a su vez puede ocasionar inmunosupresión e incluso la muerte (Olivera et al 2008) Por este motivo la implementación de agentes anestésicos se constituye en una alternativa eficiente para mitigar los efectos de la manipulación.

Dentro de los anestésicos de uso frecuente en peces se incluyen: sulfato de quinaldina, tricainametanosulfonato (MS222), 2-fenoxietanol, benzocaína, entre otros Sin embargo, algunos de estos compuestos son considerados tóxicos para algunas especies acuáticas (Roubach et al 2005) Actualmente, el único anestésico aprobado por Food and Drug Administration (FDA) y Environmental Protection Agency (EPA) es el MS222 para ser utilizado en peces de consumo (Velasco-Santamaría et al 2008) No obstante, se ha demostrado que el MS222 eleva los niveles de cortisol en plasma de peces completamente anestesiados (Coyle et al 2004) Alternativamente se han descrito técnicas de anestesia física que incluyen el uso de electricidad (electronarcosis), gas a presión o bajas temperaturas (Renault et al 2011).

Dentro de los anestésicos no convencionales se encuentra el eugenol el cual ha sido probado en peces de agua dulce, marinos y moluscos y demostró alta efectividad y seguridad (Munday & Wilson, 1997; Keene et al 1998; Taylor & Roberts, 1999; Griffiths, 2000; Lellis et al 2000; Prince & Powell, 2000; Durville & Collet, 2001; Woody et al 2002; Pirhonen & Schreck, 2003; Seol et al 2007) Este derivado fenólico posee una consistencia liquida - aceitosa, poco soluble en agua y soluble en alcohol (Skinner, 1994) El eugenol ^(C10^H12^O2) se obtiene de hojas, flores, tallos y brotes de árboles de clavo (Eugenia caryophyllata y Eugenia aromatica) (Soto & Burhanuddin, 1995) Pirhonen & Schreck, (2003) reportan en trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) disminución del consumo de alimento 4 horas posteriores a la anestesia con MS-222 y aceite de clavo Sumado a esto algunos autores han descrito que a temperaturas altas se induce un período de recuperación más largo y, potencialmente, reduce el margen de seguridad (Hikasa et al.1986).

El presente estudio fue realizado para determinar la concentración letal 50 del eugenol en cachama blanca (Piaractus brachypomus) expuestas durante 96 horas.

Metodología

Localización

El experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de Toxicología de la Universidad del Tolima, adscrito a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, en la ciudad de Ibagué, capital del departamento del Tolima, localizada a 1.248 m s n m Con una temperatura promedio anual de 22°C, precipitación anual de mm y una humedad relativa del 50%.

Animales

Para los ensayos preliminares así como para el experimental se utilizaron alevinos de cachama blanca (Piaractus brachypomus) de 3.5 ± 0.5 g, obtenidos del Instituto de Acuicultura de los Llanos (IALL), criados en estanques de tierra y provenientes de un mismo desove.

Los animales fueron aclimatados por un periodo de 15 días bajo las condiciones de laboratorio y fueron alojados en acuarios de vidrio con un volumen cercano a los 30 litros, con aireación constante sin filtro Durante el periodo de aclimatación los peces fueron alimentados con concentrado comercial (30% de proteína) con una ración correspondiente al 2% de la biomasa total Los procedimientos fueron de carácter no invasivo y aprobados por el Comité de Ética del centro de Investigaciones de la Universidad del Tolima.

Diariamente, fueron medidos los parámetros de calidad de agua correspondientes a: pH, sólidos disueltos, temperatura (pHMeter Multiparametric Hanna Instruments^®) y oxigeno disuelto (OXXI 330i/set Germany).

Sustancias experimentales

Se utilizó Eugenol^® (The J Bird Moyer Co , Inc, USA ), (4-alil, 2-metoxifenol), obtenido de una casa comercial, (densidad de 1 04 g/mL (~1000 mg/mL) Para el uso como anestésico se realizó una dilución de 1:9 (v/v) con etanol para lograr una concentración final de 100 mg/mL de eugenol en la solución stock.

Diseño experimental

Para determinar la CL_50-96, se utilizaron 90 alevinos que fueron expuestos a 7 concentraciones de eugenol (8, 12, 15, 18, 25, 35, 45 mg/L) y un grupo control, así mismo un grupo de peces fueron sometidos durante todo el periodo experimental al diluyente del anestésico (etanol al 99.5% disuelto en agua) para discriminar su posible efecto anestésico o tóxico. En cada una de las concentraciones experimentales se utilizaron 10 animales incluyendo el grupo control y el grupo con diluyente durante 96 horas Se evaluó el comportamiento de los peces desde el momento en que se introdujeron al acuario con su respectivo tratamiento Durante el periodo experimental, se manejó un modelo semiestático con recambio diario del 50% del contenido del acuario para evitar cambios en la concentración del anestésico por evaporación Los experimentos fueron realizados siguiendo los lineamientos descritos por Organisation for Economic Cooperation and Development (OECD, 1992).

Concentración letal 50 (CL₅₀)

Para determinar la concentración letal 50 se utilizó el software Trimmed Spearman-Karber), basado en la mortalidad acumulada a las 96 horas (Hamilton et al 1977) con nivel de confianza de p<0.05

Resultados

Los animales sometidos a las diferentes concentraciones de eugenol presentaron frecuentemente episodios de nado con hiperactividad esporádica y no se evidenció un patrón específico de distribución en los tercios de los acuarios Los animales sometidos al solvente (i.e. etanol) no evidenciaron comportamientos anormales, ni signos compatibles con algún estado anestésico o de toxicidad Los patrones de comportamiento observados se caracterizaron por la pérdida del eje de nado, nado en espiral y nado hacia la superficie a concentraciones bajas (8, 12, 15, 18 mg/L), mientras que en las concentraciones altas (25, 35, 45 mg/L) se observó una rápida inducción a la anestesia y disminución pronunciada hasta el cese de los movimientos operculares hasta producirse la muerte.

El valor de la CL_50-96 del eugenol en alevinos de cachama blanca corresponde a 18.2 mg/L (p<0.05) Para las concentraciones de 25, 35 y 45 mg/L, se presentó una mortalidad del 100% de los sujetos experimentales a las 24 horas de exposición Mientras que en la concentración de 18 mg/L se registró una mortalidad del 60% En las concentraciones menores a 18 mg/L no se evidenció mortalidad (Figura 1).

Discusión

El eugenol como sustancia anestésica en peces requiere estudios de toxicidad que permitan inferir en cada especie en particular su margen de seguridad y validen su uso en prácticas de acuicultura tales como desove, pesaje, morfometría, intervenciones quirúrgicas, toma de biopsias, entre otras.

 

Figura 1. Porcentaje de mortalidad acumulada a las 96 horas a diferentes concentraciones de Eugenol. Cada cuadrante de la circunferencia representa el porcentaje de mortalidad registrado durante en el periodo correspondiente de exposición.

 

Aunque se han adelantado estudios relacionados con la farmacodinamia del eugenol en peces y otras especies (Guénette et al 2007ab), el mecanismo de acción aún está en investigación Estudios invitro han demostrado la interacción del eugenol bloqueando los receptores vaniloides (TRPV1- Transient receptor potential vanilloid 1) inhibiendo así la transmisión del dolor (Yang et al. 2003) El eugenol también inhibe el receptor N-metil D-aspartato (NMDA) del gutamato y es agonista del neurotransmisor acido gamma aminobutírico (GABA) de acuerdo a lo reportado por Sladky et al. (2001), que causan depresión del Sistema Nervioso Central (SNC) y a esto se debe su efecto anestésico, por ende su toxicidad puede estar mediada por la fuerte depresión del centro respiratorio (Guénette et al 2007b)

La evaluación de la toxicidad aguda del eugenol ha sido descrita en diferentes especies de organismos acuáticos Así, en invertebrados acuáticos como el caracol de agua dulce Biomphalaria alexandrina se registra una CL₅₀ de 28 mg/L (Din, 2006) y en algunos artrópodos de 74 5 μg/mL (Sampaio et al. 2009).

Para peces de agua dulce se ha descrito la CL₅₀ del eugenol que oscila entre 14 y 60 mg/L En este trabajo se determinó la CL_50-96 de eugenol en 18 2 mg/L en alevinos de cachama blanca, lo cual concuerda con lo reportado para bagre europeo (Silurus glanis L ) 18 4 mg/L (Velisek et al. 2006), 18 1 mg/L en carpa común (Cyprinus carpio L.) y en trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) de 14 1 mg/L (Velisek et al. 2005) Acorde con lo hallado en el presente estudio, Soto & Burhanuddin (1995) encontraron que en el pez conejo de mancha dorada (Siganus guttatus se inicia la muerte a las 20 horas de exposición a 15 mg/L de eugenol De la misma manera, Charoendat et al (2009), describen la CL₅₀ a 24 horas del eugenol en 16 98 mg/L para alevinos de tilapia nilótica (Oreochromis niloticus) No obstante, Gullian & Villanueva (2009) reportan la CL₅₀ de 60 mg/L en juveniles de cobia (Rachycentron canadum) que difiere considerablemente de lo encontrado en este estudio.

Agradecimientos

A los miembros del Grupo de Inmunología y Fisiopatología Animal (IFA) por el acompañamiento en las labores diarias del sostenimiento de la fase experimental, al personal del Laboratorio de Toxicología y del Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad del Tolima por permitir el establecimiento del experimento y el apoyo constante de este

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