Artículo Original/Original Article
Caracterización de Microorganismos Fúnicos en Semillas de Arazá (Eugenia stipitata)
Characterising fungal microorganisms in Amazon peach seeds (Eugenia stipitata)
C. Torres1, N. D. Correa2, J.E. Díaz3
1 Ingeniero Agrónomo, Profesora Asociada, Universidad del Valle. [email protected]
2 Biólogo, Universidad del Valle
3 Ingeniero Agrícola. Profesor Titular, Universidad del Valle. [email protected]
Recibido: Febrero 13 de 2008. Aceptado: Marzo 13 de 2008
RESUMEN
Se caracterizaron microorganismos fúngicos, presentes en semillas de Arazá (Eugenia stipitata), provenientes de cultivos ubicados en el departamento del Caquetá. Se determinó el porcentaje de humedad y germinación de las semillas. Se estableció una relación de los agentes patógenos para las primeras etapas de crecimiento y desarrollo de la planta. Se identificaron dieciséis (16) géneros de hongos, de los cuales dos presentaron micelio estéril. Siete de los microorganismos fúngicos resultaron ser reconocidos patógenos de plantas, seis saprófitos facultativos (los cuales en condiciones de estrés pueden llegar a ser patógenos) y uno de carácter antagonista. Se obtuvo un porcentaje de humedad en las semillas del 12.6% y la tasa de germinación para semillas sometidas a desinfección fue del 11%, corroborando reportes anteriores sobre su recalcitrancia.
PALABRAS CLAVES: patógenos, recalcitrancia, saprófitos, semillas.
SUMMARY
Fungal microorganisms present in Amazon peach (Eugenia stipitata) seeds from crops (locally known as araza) being grown in the Caquetá department were characterised. Humidity and seed germination per- centages were determined. An account was made of pathogenous agents for the first stages of plant growth and development. Sixteen fungal genera were identified, two of them presenting sterile mycelia. Seven of the fungal microorganisms were recognised as being plant pathogens, six facultative saprophytes.
Key words: pathogen, recalcitrance, saprophyte, seed.
INTRODUCCION
El Arazá, (Eugenia stipitata) perteneciente a la fa- milia Myrtaceae, es un arbusto arborescente originario probablemente de la Amazonía peruana (Mc. Vaugh,1956). Se encuentra en estado silvestre y se presume que su domesticación comenzó en el occidente de la Amazonía (Filgueiras et al.,2002). En Brasil y Perú los cultivos son extensos, pero sigue siendo parte de la agricultura tradicional de la región (Giacometti y Lleras,1992). Su tecnificación es escasa, encontrando que Ecuador y Colombia, poseen cultivos de poca extensión. En Colombia, los cultivos se reducen a muy pocas regiones de los departamentos de Caquetá, Amazonas, Putumayo (Barrera et al.,2001) y recientemente se está incorporando a regiones del Tolima y Valle del Cauca. En estado silvestre presenta porte erecto alcanzando los 20m de altura y al rededor de 6m en plantaciones agrícolas (Falcao et al.,1988). Se adapta a suelos pobres y ácidos, de clima tropical y subtropical (Giacometti y Lleras,1999). Posee hojas elípticas opuestas con ápice acuminado y base obtusa a redondeada. Las flores son hermafroditas y se encuentran en inflorescencias de hasta 5 flores por unidad. (Osorio et al.,2001). El fruto es tipo baya, oblongo, de color verde opaco en sus primer estado y amarillento claro en su estado maduro. Su peso varía entre 150 y 800g (Ferreira,1992; Escobar y Zuluaga,1996). Las semillas son de tipo reniforme y alcanzan tamaños entre (1.4-2.5)cm. de largo, y ancho entre (1-1.8)cm. El peso de las semillas fluctúa entre (1-4.3)g, aproximadamente (Osorio et al.,2001). El fruto tiene una alto contenido de proteínas, lípidos, fibras, tiamina, riboflavina, vitamina C, calcio, potasio, magnesio, sodio, fósforo y hierro (Filgueiras et al.,2002). Es apto para producir distintos productos como jugos, mermeladas (Calzada, 1985; Picón, 1989; Araujo y Ribeiro, 1996; Andrade et al.,1997). También se obtiene pulpa congelada (Villachica et al.,1996), fruta disecada (Flores,1997) e incluso, sustancias para la elaboración de perfumes, debido a su particular aroma (Swift y Prentice,1983; Clement,1990; Villachica et al.,1996). Sus posibilidades comerciales lo convierten en materia de interés y es conveniente identificar los posibles agentes patógenos que afecten la semilla para facilitar el desarrollo de paquetes tecnológicos que permitan mejorar las técnicas de cultivo.
MATERIALES Y METODOS
Para las pruebas de germinación y cultivo de microorganismos se utilizaron semillas procedentes de la región amazónica colombiana, extraídas de frutos maduros y frescos de la subespecie sororia, suministradas por Corpoica Macagual, (latitud 1º30’ N, longitud 75º 44’ O). Las semillas se seleccionaron de forma aleatoria para cada una de las pruebas y tratamientos, eliminando impurezas de manera manual y lavándolas con agua destilada. Los análisis se realizaron en el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad del Valle. Se emplearon cuatro gramos de semilla picada para la prueba de contenido de humedad.
Para la detección de microorganismos fúngicos se tomó un grupo de semillas que fue dividido en dos bloques de 90 semillas, colocando cada uno de ello en alcohol al 70% durante 30 segundos. Adicionalmente un bloque se desinfecto con una solución de hipoclorito de sodio al 5% durante un minuto. Cada bloque de semillas fue sembrado en cajas de Petri, cinco por caja para un total de 18, empleando como medio de cultivo agar papa dextrosa (International Seed Testing Association,1999). Para la siembra de muestras (Figura 1) se siguió la metodología de aislamiento de hongos fitopatógenos (Ávila,2004; Torres,2004). Se practicaron observaciones diariamente y se registró el crecimiento de las diferentes colonias morfológicamente diferenciadas. Figura 1.
Figura 1. Siembra de semillas en medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA)
Para cada microorganismo aislado y de acuerdo a los diferentes morfotipos de hongos que se manifestaron en los medios de cultivo, se realizó un análisis cualitativo macroscópico de manera continua, considerando la textura, topografía de la colonia, color, crecimiento y formación de estructuras reproductivas en la superficie. Las descripciones de las colonias en cada aislamiento, fueron elaboradas de acuerdo a protocolos existentes.
Se realizó la identificación de los microorganismos utilizando tinción de muestras con lactofenol. Se observaron estructuras somáticas y reproductivas (conidias, conidióforos, tipos de hifas y coloraciones). Se realizaron placas con los microhongos usando dos técnicas: la primera, con microcultivos aislados de las muestras fúngicas obtenidas a partir de las manifestadas inicialmente en presencia de las semillas; y la segunda, colocando colonias de hongos sobre portaobjetos con el uso de cinta adhesiva (Cuero, 1979). La caracterización e identificación de los hongos se realizó a través de claves morfológicas (Barnett y Hunter, 1972; Ellis, 1971; Sañudo et al., 2001; Garcés et al.,2003; Ávila,2004).
La prueba de germinación de semillas se llevó a cabo en condiciones semi-controladas, bajo las siguientes características: Humedad relativa media de 71%, Temperaturas entre (22º-34º)C. Se utilizaron 192 semillas, distribuidas en dos tratamientos; semillas desinfectadas y semillas sin desinfectar. (Tabla 1). Para cada uno de los grupos tratados previamente con agua destilada estéril se emplearon 96 semillas, que fueron sembradas a una profundidad de l.5cm., en arena previamente esterilizada, puesta en recipientes de aluminio agujerados en su base. Cada recipiente era humedecido diariamente con agua hervida. La prueba se llevó a cabo durante 140 días.(Figura 2). Tabla 1.
Figura 2. Montaje de semillas sembradas en arena estéril
Tabla 1. Características de la prueba de germinación de semillas
Para la prueba de contenido de humedad se maceraron cuatro gramos de semilla sometiendo las muestras a temperatura constante de 103ºC durante 17 horas.
Los datos se analizaron mediante tablas de distribución de frecuencias y diagramas porcentuales.
Se realizó un análisis estadístico, no paramétrico de tipo Chi-cuadrado, con un nivel de confianza del 95% para determinar la existencia de comportamientos aleatorios en la aparición de las colonias fúngicas para los diferentes tratamientos. Adicionalmente se elaboró un análisis adicional Chi-cuadrado en el caso particular de los cinco géneros de hongos presentes en los dos tratamientos.
RESULTADOS
Manifestación y diagnóstico de microorganismos fúngicos
Los dos grupos de semillas mostraron crecimiento y desarrollo de hongos de diversas morfologías y géneros. El tratamiento de semillas sin desinfectar, presentó el 100% de crecimiento de al menos, una colonia de hongo. Para el tratamiento de semillas desinfectadas, se encontraron 66 colonias fúngica (73%), fenómeno que se presentó en la totalidad de las 18 cajas de Petri pertenecientes a este tratamiento. Se considera que el desarrollo fúngico en las semillas desinfectadas se debió a la existencia de esporas de hongos en el endospermo.
En ambos tratamientos, se identificaron 14 géneros diferentes y otros dos géneros adicionales presentaron el micelio estéril en todas las observaciones registradas, sin que fuera posible detectar estructuras reproductivas, impidiendo su identificación.
Varios de los géneros observados, presentaron manifestaciones diferentes y características macroscópicas diversas, probablemente debido a la posibilidad de que una misma especie, tome coloraciones o texturas diferentes en cultivos separados (Garcés et al., 2003).
Análisis cualitativo de los microorganismos observados
De los cinco géneros registrados presentes en ambos tratamientos, tres son considerados de carácter fitopatógeno (Colletotrichum sp, Fusarium sp y Curvularia sp), y dos como saprofitos facultativos u oportunistas (Aspergillus sp, Penicillium sp). Para ambos tratamientos se presenta en la Tabla 3 la descripción cualitativa de los microorganismos fúngicos.
Respecto a los cuatro géneros identificados para el tratamiento de semillas no desinfectadas dos son reconocidos fitopatógenos (Rhizoctonia sp, Geotrichum sp), uno es un parásito ocasional (Thielaviopsis sp) y otro es antagónico neutralizador de otros hongos (Trichoderma sp). Adicionalmente se registraron otros dos microorganismos (H1,H2), los cuales, al presentar micelios estériles, no se lograron identificar.
Tabla 2. Presencia de hongos en cada uno de los grupos de semillas evaluados
El análisis cualitativo de los microorganismos fúngicos presentes únicamente en el tratamiento de semillas no desinfectadas se presenta en la tabla 4.
Respecto a los cinco géneros fúngicos encontrados en las semillas sometidas a desinfección, dos son de reconocido carácter fitopatógeno (Pestalotia sp, Cladosporium sp, Helmintosporium sp), mientras que los otros tres son saprofitos facultativos u oportunistas (Rhizopus sp, Myrothecium sp).
La tabla 5 muestra el análisis cualitativo de los microorganismos fúngicos presentes únicamente en el tratamiento de semillas desinfectadas es el siguiente:
Frecuencias relativas de los microorganismos presentes en ambos tratamientos
Se encontraron cinco géneros presentes en los dos grupos de semillas. Once se detectaron únicamente en alguno de los dos tratamientos evaluados. En el caso de los hongos presentes en ambos tratamientos, se registraron frecuencias de tamaño considerable (Figuras 3 y 4). Aspergillus sp fue el género con el mayor número de registros, para ambos tratamientos de semillas, alcanzando el 28% de presencia en semillas desinfectadas, mientras que en las no desinfectadas el porcentaje fue de 22%.
Germinación y contenido de humedad de las semillas
La germinación de las semillas registró pocos eventos exitosos. Del tratamiento de semillas desinfectadas germinó el 11,5%, de las 96 semillas. Para éste tratamiento la primera germinación se presentó el día 48. Posteriormente, durante los días 59, 60 y 61, se registró la germinación de otras cinco semillas, las cuales desarrollaron hipocótilos de 1.5 a 4.5 cm. Por último en los días 65 y 66, germinaron las últimas cinco semillas las cuales desarrollaron hipocótilos de 1.4a 3.6cm.
Tabla 3. Géneros registrados en ambos tratamientos
Tabla 4. Microorganismos fúngicos presentes en el tratamiento de semillas no desinfectadas
Tabla 5. Microorganismos fúngicos presentes en el tratamiento de semillas desinfectadas
Figura 3.Frecuencias relativas de manifestación de los microorganismos detectados en los tratamientos. (a) Semillas desinfectadas (b) semillas no desinfectadas
Figura 4. Comparación de las frecuencias relativas de los géneros observados en ambos tratamientos
El tratamiento de semillas no desinfectadas, solo registró germinación del 1%, del total de las 96 semillas, la cual se presentó en el día 70.
Tabla 6. Relación de los eventos germinativos exitosos y su día de ocurrencia (cada “X” representa una semilla germinada)
Resultado de la prueba de contenido de humedad de la semilla
El contenido de agua en la semilla fue del 12.6%, comparativamente alta con la registrada para otros integrantes de la familia Myrtaceae, como Psidium guajaba (5.5%) y Eucalyptus globulus (6%).
Los registros de Aspergillus sp fueron la mayoría de los 16 géneros hallados. Según Kozakiewicz (1989) se debe a la capacidad que posee Aspergil- lus sp para crecer a diferentes temperaturas y sobre sustratos con variados contenidos de humedad. Además, la mayoría de especies de este hongo puede desarrollarse sin problemas en semillas que contengan un porcentaje de humedad, entre el 10 y el 20% y la colonización de semillas por parte de este moho, se produce de forma explosiva cuando la humedad relativa del ambiente intergranular es superior al 70%, sin desencadenar aún el fenómeno de germinación (Eguiazú 1984). Por lo tanto las semillas de E. stipitata, con registros de contenido de humedad promedio del 11.5%, constituyen hospederos adecuados para su desarrollo. Especies vegetales (Swift,1997). De acuerdo con Vera et al.(2002) el Arazá ha logrado aprovechar la presencia de estos dos hongos en su rizósfera para la obtención principalmente de fósforo.
Colletotrichum sp, registró mayor presencia en el tratamiento de semillas desinfectadas (17%), en comparación con las semillas no desinfectadas (11%), lo cual indica que es un hongo asociado al endospermo de la semilla. La mayor frecuencia obtenida para las semillas sometidas a desinfección, podría deberse a que en dicho tratamiento no hubo presencia de ningún hongo de carácter antagonista que logre neutralizar el desarrollo de cepas fitoparásitas, como es el caso de Trichoderma sp (Villegas y Castaño,2000) fenómeno que sí se registró en semillas sin desinfección.
Con respecto a Fusarium sp, parásito necrótico de gran ubicuidad (Nicholson,2001), y amplia tolerancia a los cambios de pH (Carrillo,1990), su incidencia en las semillas es mayor en las no desinfectadas que en las sometidas a desinfección (17 y 6% respectivamente). Sin embargo, salvo F. culmorum, el cual crece en un rango de temperatura de 5-15ºC (Backhouse,2001), los fusarios no compiten bien con las especies de Aspergillus y Penicillium (Lacey,1989). En los dos tratamientos realizados, ninguna cepa de Fusarium se observó en semillas que mostraron crecimiento de Aspergillus sp, lo que corrobora su vulnerabilidad frente al antagonismo (Seifert, 2001).
Penicillum sp mostró una frecuencia del 17% para las semillas desinfectadas y del 7% para el tratamiento complementario, al igual que Aspergillus sp, es un género que no se afecta por la incidencia de luz, esporulando fácilmente en oscuridad (Lacey,1989). Curvularia sp, parásito facultativo de vegetales, se encuentra principalmente en el trópico y el subtrópico (Anaissie et al.,1989) y registró una frecuencia mayor en las semillas desinfectadas (11%, contra el 6% del otro tratamiento).
Frecuencias relativas de los microorganismos presentes en un solo tratamiento
La frecuencia relativa de los 11 géneros de microhongos presentes en uno de los dos tratamientos de semillas (Figura 5), fue menor a las exhibidas por los hongos presentes en ambos grupos de semillas. Rhizoctonia sp y Cladosporium sp, presentaron los mayores porcentajes con 17% y 14% respectivamente. En contraste, Myrothecium sp, causante de necrosis y clorosis (Bunster y Torres2003) y el hongo no identificado H (micelio estéril), fueron observados con una frecuencia, del 1%.
Figura 5. Frecuencias relativas de los géneros observados en uno de los dos tratamientos
Por su parte Rhizopus sp, Geotricum sp, Thielaviopsis sp y Trichoderma sp, presentaron frecuencias respectivas de 11%, 9%, 6% y 4%. De acuerdo con Garcés et al. (2003) Rhizoctonia sp es un microorganismo patógeno generalista el cual, en compañía con otros hongos de naturaleza semejante, parásita estructuras vegetales diversas, provoca necrosis y marchitamiento en plantas recién emergidas (Barnett y Hunter, 1992). Geotrichum sp, microorganismo propio de los suelos es un hongo patógeno facultativo, encontrado en pulpa de fruta y genera inconvenientes para la fermentación industrial de yogurt (Barnett y Hunter,1992). Trichoderma sp, es un hongo Deuteromicete, caracterizado por presentar un estado sexual indeterminado (Rodríguez y Arcia, 1993). De este microorganismo existen más de 30 especies, todas con efectos benéficos para la agricultura, debido a la notable capacidad antagónica y degradante de agro tóxicos (Páez et al., 2006) y a su competencia para controlar satisfactoriamente numerosas especies de hongos fitopatógenos.
Prueba Chi-cuadrado entre tratamientos
En ambos tratamientos (semillas desinfectadas y semillas sin desinfectar) se determinó una distribución no aleatoria señalando diferencias significativas en la proporción de hongos encontrados en ambos tratamientos. Para el caso de los hongos latentes en el interior de las semillas, los tratamientos en semillas desinfectadas y sin desinfectar indicaron que su distribución no es aleatoria. Al comparar la distribución de los hongos hallados en ambos tratamientos, el estadístico de prueba (EP=ó2 (0.05, 2)=125.9> 5.99), indica que sus distribuciones no son explicables por la aleatoriedad.
Prueba Chi-cuadrado para los microorganismos hallados en ambos tratamientos
Al aplicar la prueba en cada uno de los cinco géneros hallados en los dos tratamientos (Aspergillus sp, Colletotrichum sp, Fusarium sp, Penicillum sp, Curvularia sp), se encontró que los patógenos no están presentes en las mismas proporciones en los dos grupos de semillas.
Con relación a la germinación la mayor cantidad de eventos se produjo entre los días 59 y 66, pero el proceso se detiene a partir del día 70. Para el grupo del Araza la principal dificultad para la germinación de las semillas se debe a la resistencia mecánica del tegumento (Pinedo,1984). Sin embargo, tal explicación parece no ser del todo satisfactoria frente a las dificultades germinativas experimentadas aún con la remoción del tegumento (Ferreira y Gentil,1999)
consideran que el rango óptimo de temperatura para emergencia de la raíz primaria varía entre 15° y 30° ; y para emergencia del epicótilo entre 20°, 30° respectivamente. Temperaturas superiores a 35°C parecen ser letales para las semillas de Arazá (Anjos, 1998). En el caso del Araza la principal dificultad para la germinación de las semillas se debe a la resistencia mecánica del tegumento (Pinedo, 1984). Sin embargo, tal explicación parece no ser del todo satisfactoria frente a las dificultades germinativas experimentadas aún con la remoción del tegumento (Ferreira y Gentil,1999).
En el caso del contenido de humedad de la semilla, aunque el porcentaje reportado fue bajo, según Bello (1989), las semillas de los frutos maduros de E. stipitata, aptas para germinación, presentan contenidos de humedad del 50%. Anjos (1998) y Ferreira y Gentil (1999), reportan humedades en semilla de Arazá que oscilan entre el 48.4% y 73.1%.
CONCLUSIONES
Se encontraron 14 géneros de microorganismos fúngicos asociados a la semilla de Arazá, y dos más sin identificar, debido a sus micelios estériles. Los microorganismos se encontraron directamente en el endospermo de la semilla y fueron extraídos del tratamiento de semillas desinfectadas.
Cinco de los géneros reportados en las semillas desinfectadas son de carácter oportunista (Colletotrichum sp, Fusarium sp, Curvularia sp, Pestalotia sp y Cladosporium sp) y cinco son de carácter patógeno y de naturaleza oportunista (Aspergillus sp, Penicillium sp, Rhizopus sp, Myrothecium sp y Helmintosporium sp). Se detectaron microorganismos fúngicos asociados a la testa de la semilla, los cuales fueron extraídos del tratamiento de semillas sin desinfectar.
De los 9 géneros identificados, hallados en el tratamiento de semillas sin desinfectar, Colletotrichum sp, Fusarium sp, Curvularia sp, Thielaviopsis sp, Rhizoctonia sp y Geotrichum sp son reconocidos fitopatógenos; Aspergillus sp y Penicillium sp son de carácter oportunista y Trichoderma sp es antagónico neutralizador de otros hongos. Se registraron también dos hongos más con el micelio estéril.
Se confirmó que la distribución de los microorganismos en los tratamientos no era aleatoria y por tanto, existen diferencias significativas entre los tratamientos y entre las frecuencias de aparición de los microhongos
Se confirmó la sensibilidad de la semilla frente a variaciones de la humedad, encontrándose una correlación directamente proporcional con la tasa germinativa.
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